HPLC یا کروماتوگرافی مایع با کارایی بالا چیست؟

 HPLC یا کروماتوگرافی مایع با کارایی بالا چیست؟

High Performance Liquid Chromatography (HPLC)

آنالیز HPLC یا کروماتوگرافی مایع با کارایی بالا (High Performance Liquid Chromatography) یکی از روش های مهم در علم شیمی است که برای جداسازی، شناسایی و اندازه گیری مقادیر کم از مواد مورد استفاده قرار می گیرد HPLC از دو فاز ثابت و متحرک تشكيل شده است. كه فاز ثابت ممكن است جامد و يا مايع باشد و فاز متحرک مايع است. HPLC بدون شک، سریع‌ترین رشد را در بین تمام روش‌ های جداسازی تجزیه ‌ای با فروش سالیانه در گستره بیلیون دلار داشته است. دلایل این رشد انفجارآمیز عبارتند از حساسیت روش، سازگاری سریع آن برای انجام اندازه‌ گیری‌ های کمی صحیح، شایستگی آن برای جداسازی مواد گونه ‌های غیرفرار یا ناپایدار در مقابل گرما و مهم‌ تر از همه، کاربرد گسترده آن برای موادی است که در صنعت، زمینه ‌های مختلف علوم و جامعه اهمیت درجه اول را دارند.

مزیت کروماتوگرافی نسبت به ستون تقطیر این است که به آسانی می‌توان به آن دست یافت. با وجود اینکه ممکن است چندین روز طول بکشد تا یک ستون تقطیر به حداکثر بازده خود برسد، ولی یک جداسازی کروماتوگرافی می‌تواند در عرض چند دقیقه یا چند ساعت انجام بگیرد. یکی دیگر از مزایای برجستة روش های کروماتوگرافی این است که آن ها آرام هستند. به این معنی که احتمال تجزیة مواد جدا شونده به وسیله این روش ‌ها در مقایسه با سایر روش ‌ها کمتر است.

مزیت دیگر روش‌ های کروماتوگرافی این است که تنها مقدار بسیار کمی از مخلوط برای تجزیه لازم است. به این علت، روش های تجزیه ‌ای مربوط به جداسازی کروماتوگرافی می‌توانند در مقیاس میکرو و نیمه میکرو انجام گیرند. در ابتدا روش ‌های ساده‌تری مانند کروماتوگرافی کاغذی و لایه نازک امتحان می‌شوند. در صورتی که با این روش ها مستقیما قادر به جداسازی باشند، جداسازی را باید به وسیلة آن ها صورت داد. کروماتوگرافی مایع با کارایی بالا (HPLC)، وقتی که روش‌ های ساده فاقد کارایی لازم هستند، می‌تواند جوابگو باشد.

کاربرد HPLC برای موادی است که در صنعت ، زمینه‌ های مختلف علوم و جامعه اهمیت درجه اول را دارند. مثال‌ هایی از این موارد عبارت‌اند از : اسیدهای آمینه، پروتئین‌ها، اسیدهای نوکلئیک، هیدروکربن ها، هیدرات های کربن، داروها، ترپنوئید ها، حشره‌کش‌ها، آنتی ‌بیوتیک ها ، استروئید ها ، گونه ‌های آلی یا فلزی و گروهی از مواد گوناگون معدنی.

بخش های مختلف دستگاه HPLC و نحوه عملکرد آن ها در زیر شرح داده شده اند :

• مخازن حلال
• پمپ
• انژکتور
• ستون
• آشکار ساز
• کنترل کننده
• گازگیر

مخازن حلال

که در آن ها فاز متحرک و یا حلال ‌های شست و شو دهنده ستون ریخته شده است.

پمپ (Pump)

کار پمپ دستگاه اچ پی ال سی آنچنان که از نامش پیداست، پمپاژ حلال و یا حلال ها با فشار بسیار زیاد تا حدود 40 مگا پاسکال و یا بیشتر به سمت ستون کروماتوگرافی است. این واحد معمولا از یک تا چهار حلال را به سمت ستون پمپاژ می نماید که بسته به متد های کاری تغییر می کند. در مواقعی که از یک حلال در دستگاه HPLC استفاده می شود به آن اصطلاحا ایزوکراتیک یا تک حلاله گفته می شود. در مواقعی نیاز هست تا از ترکیب ثابت دو یا چند حلال و یا ترکیب متغیر با زمان (برنامه زمانی) استفاده شود که به این سیستم باینری و یا کواترنری یا چند حلاله و یا گرادیانت می گویند. سیستم های باینری معمولا از سر هم بندی یا کوپلینگ 2 پمپ همزمان ساخته می شوند و در مواقعی با استفاده از یک سیستم شیر چهار مسیره قابل کنترل با کامپیوتر که به ورودی پمپ متصل شده می توان از ترکیب ثابت و یا متغیر با زمان همه حلال ها استفاده نمود.

انژکتور (Injector)

انژکتور Injector)) در واقع نقش تزریق کننده نمونه مورد آنالیز به داخل حلال عبوری را در دستگاه کروماتوگراف مایع بازی می کند. این بخش سیستمی است متشکل از چند مسیر که می تواند بین پمپ و ستون قرار گرفته و بتواند در حین عبور حلال یا فاز حامل با فشار زیاد مقدار معینی از نمونه را به داخل آن هدایت نماید. مقدار ثابت نمونه در داخل لوله ای با حجم مشخص به نام لوپ در کمین نشسته تا در لحظه فرمان کاربر سوار موج حلال شده و به سمت ستون کروماتوگرافی حرکت نماید. انژکتور اتوماتیک و یا Autosampler نیز نوع رباتیک این سیستم می باشد که می تواند تعداد بسیار زیادی از نمونه را طبق برنامه داده شده کاربر به داخل حلال تزریق نماید.

ستون (Column)

ستون کروماتوگرافی و یا column مرکز جداسازی اجزای نمونه در کروماتوگرافی مایع است. ستون HPLC لوله ای است فلزی که با مواد نیمه تراوا از جنس خاک دیاتومه با خلل و فرج فراوان پر شده است که حلال و نمونه حل شده تنها با اعمال فشار از داخل آن عبور داده می شود. عملکرد این ستون ها به زبان ساده نگهداری و رها سازی مولکول های جزء به جزء ترکیب به ترتیب بزرگی و یا چسبندگی مولکول ها و قدرت شستشوی نمونه توسط حلال می باشد. ستون ها بسته به جنس محتوا و قطبیت و طول دارای انواع بسیار متنوعی می باشند که از مصطلح ترین آن ها ستون C18 و C8 می باشد.

آشکار ساز (Detector)

دتکتور دستگاهی است که بنابر خاصیتی مثل میزان جذب می تواند غلظت نمونه را دستگاه کروماتوگراف مایع بسنجد، در بیشتر موارد دتکتور کروماتوگراف یک سیستم اسپکتروفتومتر است که در طول موج خاصی می تواند مقدار و نوع نمونه را نمایش دهد و این دتکتور SPD نامیده می شود. از دیگر دتکتور های کروماتوگراف می توان از دتکتور RID نام برد که بر اساس ضریب شکست نمونه آن را شناسائی و مقدارسنجی می نماید. دتکتور RF، براساس میزان فلورسانس نمونه. دتکتور MS براساس جرم مولکولی.

کنترل کننده (Controller)

کنترلر در دستگاه کروماتوگراف مایع بخشی است که ماژول های دیگر را کنترل نموده و ارتباط همه بخش ها و کامپیوتر را برقرار می نماید. در پایان اطلاعات اجزای ترکیب به صورت نمودار یا اصطلاحا کروماتوگراف روی نمایشگر قابل دستیابی است.

گازگیر (Degasser)

قبل از ورود حلال به داخل پمپ در دستگاه  HPLC، باید هر گونه حباب هوا و یا گاز دیگر و یا هوای حل شده در حلال از آن زدوده شود. این کار به دو روش تزریق گاز بی اثر مثل آرگون در داخل حلال در حین لرزاندن حلال و دیگری استفاده از دستگاه گازگیر صورت می گیرد. امروزه در دستگاه HPLC بیشتر از دستگاه Degasser استفاده می شود که سیستم نیمه تراوای داخل آن گاز را تراوش نموده ولی اجازه خروج مایع را نمی دهد.